研域百科:神經干細胞的培養

因為神經干細胞(Neural Stem Cell)具有自我更新和多向分化的潛能，因而，可以選用懸浮神經球培養的方法來獲得和研討。即將胚胎腦組織處理成單個細胞后，只有具有自我更新才能的細胞才能在培養液中克隆增殖成為懸浮的神經球，并隨著傳代的進行，堅持增殖才能和向多種神經子代細胞分化的才能。

一、  神經干細胞的分別和傳代

無菌條件下取重生SD大鼠(出世48h內)腦組織，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準確分別海馬，用眼科剪將海馬剪碎后，再轉移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的無血清培養基，吸管吹打機械分別制造單細胞懸液，臺盼藍染色后細胞計數，調整細胞濃度為5×104~5個/ml，置于24孔培養板中培養，每孔參加細胞懸液500μl。待神經球構成后再次機械分別克隆制造單細胞懸液，仍以5×104個/ml的細胞濃度置于24孔培養板中培養，每孔參加細胞懸液500μl。爾后每7d機械分別克隆傳代1次，方法同前。
 
二、BrdU符號

將BrdU溶于無血清培養基，過濾除菌后參加神經球構成后再次機械分別克隆制造的單細胞懸液中(BrdU終濃度為5μmol/L)，培養7d待新的神經球構成后，將神經球轉移到預先涂布有多聚賴氨酸的培養板中，貼壁2h行BrdU免疫細胞化學染色。
 
三、  神經干細胞的誘導分化

選取部分上述傳代后構成的次代神經球栽培于預先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養板中，并參加有血清培養基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神經球于貼壁2h后行Nestin免疫細胞化學染色，另一部分神經球持續培養，調查其生長分化情況。另將一部分次代神經球機械分別制成單細胞懸液后參加有血清培養基貼壁培養，7d后分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細胞化學染色。
 
四、  條件培養液的制備

取1g雞胚的后肢骨骼肌組織，參加9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心獲得上清液，過濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養基制成條件培養液備用。
 
五、  神經干細胞的定向誘導分化

將一部分次代神經球機械分別制成單細胞懸液后分別參加條件培養液和有血清培養基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中對照貼壁培養，7d后均行ChAT免疫細胞化學染色。